Suomesta tuli osa Venäjää vuonna 1809 käydyn sodan jälkeen. Kymmenen vuotta myöhemmin linnan ensimmäisen kerroksen neljä huonetta otettiin vankilakäyttöön.

Linna korjattiin arkkitehti C. L. Engelin suunnitelmien mukaisesti vankilaksi 1836-1837. Vuosien mittaan linna muokattiin kokonaisvaltaisesti vankilatoiminnan tarpeisiin. Keskiaikaiselle sisäpihalle rakennettiin pihaa suuresti muuttaneet portaikot ja käytävät, jotta kulkeminen helpottui. Linnan kolmannen kerroksen tiloihin rakennettiin ahtaita 1x2m kokoisia yösellejä, joissa vangit viettivät yönsä. Päivisin vangit työskentelivät esimerkiksi vankilan kutomossa tai puutarhassa.

Naisvankilatoiminta alkoi Hämeen linnassa vuonna 1881. Naisvankilatoiminta päättyi päälinnassa vuonna 1953, mutta jatkui kehämuurirakennuksissa vuoteen 1972 saakka. Kuuluisimpia Hämeen linnan naisvangeista ovat Hertta Kuusinen ja Elvi Sinervo, jotka oli vangittu poliittisista syistä.